摘要 随着对植物病毒基因组结构的深入认识和病毒与植物之间相互作用分子机制的阐明，对植物病毒的遗传操作成为可能。通过基因替代、插入融合、基因互补、抗原展示等方法构建的植物病毒载体系统在基础生物学研究领域和应用研究领域发挥着重大的作用。对植物病毒系统载体构建策略及其应用进行综述，以期对研究者有所启发。
　　关键词 植物病毒；载体构建；外源基因
　　中图分类号 S188 文献标识码A文章编号1007-5739（2008）15-0132-04
　　
　　自1892年发现第1个植物病毒——烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）以来，目前世界植物病毒的种类已达909种。科学家对植物病毒以及病毒和宿主之间的相互作用进行了深入地研究，对病毒基因组序列和调控机制的认识，使科学家在20世纪80年代初期提出利用植物病毒构建载体制作生物反应器，使外源蛋白、疫苗、药物等在植物体内的表达获得极大成功，现今已有多个植物表达载体系统构建成功。
　　随着模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻、苜蓿、杨树等植物基因组序列测定的完成和更多的正在进行的植物基因组测序计划的完成，科学家们正面对大量未知功能的基因信息，现代生物学研究已进入到后基因组时代，即进行生物信息学、结构和功能基因组学、蛋白质组学研究等。如何研究如此多基因的功能是生物学家所面对的主要问题，转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS）的发现，为研究特定基因的功能提供了一个方向。尤其是携带有内源性功能基因cDNA的植物病毒载体引起宿主内源性基因沉默，因其高效率和操作简单等优点在研究植物功能基因组学的过程中发挥举足轻重的作用。
　　
　　1植物病毒载体系统的构建
　　
　　载体的构建一般选择基因组为DNA的病毒，但自然界中的植物病毒多为RNA病毒，少有DNA病毒，并且DNA病毒复制过程的复杂性使这种病毒不适于构建植物病毒载体[1]。随着逆转录酶的发现和广泛应用，将RNA病毒的基因组RNA反转录为cDNA再克隆到质粒载体中，通过质粒上的RNA聚合酶启动子，在宿主的RNA聚合酶作用下，转录成全长的病毒基因组RNA，最早由Ahlquist P等人完成第一个RNA病毒载体的构建。目前有多种RNA病毒家族的植物病毒用于构建病毒载体。
　　构建一个理想的植物病毒载体必须满足以下条件：①该病毒基因组结构和功能清楚且能高水平地复制和翻译，具有有效的启动子，能引起局部和系统感染；②病毒感染引起的症状轻微，弱毒株系；③遗传稳定不易变异；④宿主范围广；⑤感染过程简单快速，可以机械侵染；⑥外源基因包装大小不受限制；⑦易于进行遗传操作；⑧载体中不应含有引发PTGS的序列信息。不同病毒由于其基因结构和功能不同，构建载体的策略方法也不同，目前常用于构建植物病毒载体的策略包括基因替代、插入融合、基因互补、抗原展示等。
　　1.1基因替代
　　基因替代是最早用于病毒载体的构建，主要指将外源基因替代病毒基因组内对病毒增殖、移动、组装等生命过程非必须的基因，如病毒侵染非必须的外壳蛋白基因（coat protein，CP）、昆虫传播因子等。但基因替代由于是由外源基因替代病毒本身基因，相当于删除掉病毒本身基因，所以存在很大的局限性，并且还受替代基因大小的限制。最早采用基因替代策略构建的植物病毒载体为花椰菜花叶病毒（CaMV）。用人酸性成纤维生长因子（aFGF）替代CMV的2b基因侵染烟草，表达的外源蛋白具有生物学活性且表达量占烟草可溶性蛋白的5%~8%。表明通过基因替代构建植物病毒表达载体可成功获得具生物学活性的外源蛋白[2]，但被替代的基因严格受片段大小的限制，一般不能超过250bp，并且寄主范围有限，和外源基因容易发生重组而丢失，极大地限制了应用范围。
　　此后用CAT（氯霉素乙酰转移酶）、GUS、GFP等报告基因替代雀麦花叶病毒（BMV），番茄丛矮病毒（TBSV）、番茄金黄花叶病毒（TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、烟草脆裂病毒（TRV）、马铃薯X病毒（PVX）等病毒的CP基因都获得了表达载体，并且可包装的外源基因大小有了很大的提高，如PVX 载体替代的GUS基因可达到1 800bp。外源基因替代病毒载体的CP基因后，虽然获得外源基因的表达，但表达水平都较低。主要原因可能是CP与病毒的复制、局部或长距离运动以及病毒颗粒的包装、积累等有关，而外源基因的替代破坏了病毒本身的这些活性。
　　1.2基因插入融合
　　以外源基因替代病毒本身的基因打破病毒本身的基因平衡系统，造成病毒整体基因组的紊乱，引起病毒不能在宿主体内系统运动、外源基因表达水平低等不利结果。为弥补这种缺陷，采取一种新的载体构建策略——插入融合，主要指将外源基因插入到病毒本身的启动子下游，或者将带有外源启动子的目的基因插入到病毒载体基因下游，使外源基因随病毒的增殖而表达，一般外源基因插入的位点通常选择病毒的CP基因启动子位点之后。Dawson等首次将CAT基因插入到TMV的外壳蛋白启动子下游，重组载体表达CAT活性。随后对其他植物病毒CP启动子下插入外源基因也获得表达，如BMV、PVX、PVY、BSMV 、TMVE ，WDV和TEV等[4，5]，尤其PVX病毒可以侵染多种植物、复制水平高、外源基因可以高水平表达且比较稳定、无昆虫传播媒介等优点使其成为理想的构建载体。如将GUS和GFP基因插入到病毒MP和CP之间，报告基因GUS和GFP在整株植物体内获得高水平表达，且在PVX CP亚基因组启动子调控下的外源基因很少发生同源重组而丢失。如今PVX载体系统已有多种外源基因表达成功[6，7]。Zhang等将外源基因插入到菜豆夹斑点病毒（BPMV）的MP和CP基因之间，构建表达载体，为了防止同源重组造成外源基因丢失，利用密码兼并性的特点替换掉基因重复的序列，结果表明在大豆中可以很好地表达GFP、番茄丛矮病毒编码的RNA沉默抑制子等外源蛋白[8]。
　　载体中双CP亚基因组启动子序列容易发生高频重组使外源基因丢失，使后代中极易出现野生型病毒，克服这种缺陷的一种方法是采用病毒亲缘关系较近的亚基因组启动子启动外源基因表达。有研究者将其他烟草花叶病毒的亚基因组启动子插入到TMV构建了许多修饰后稳定的载体，如Kumagai 等将齿兰环斑病毒（ORSV）的CP亚基因组启动子和CP基因插入到TMV载体中，用α-天花粉蛋白基因替代TMV的CP基因，重组后的载体在烟草中成功表达具有活性的α-天花粉蛋白。
　　1.3基因互补
　　基因互补是指把外源基因插入到有功能缺陷型病毒组分或亚病毒组分内，通过感染转基因植物或辅助病毒共侵染宿主来互补缺陷的功能。虽然这种载体构建策略实际应用还没有完全普及，但在理论上已被多种病毒证实，并且已有成功的报道。Walden 等以缺陷性的CaMV病毒携带外源基因，野生型的CaMV或者另一种缺陷型的病毒作为辅助病毒共同侵染宿主，由于病毒可通过2种重组机制发生高频的重组，使外源基因丢失或出现野生型病毒而使载体的构建失败[9]。为了克服这种缺陷，Hirochika等采用2个交替突变的CaMV病毒，其中一个携带外源基因，一个作为辅助病毒共侵染宿主，这样可以降低重组发生的频率，并且2种病毒可同时存在宿主体内，还可以克服被克隆外源基因的大小限制[10]。
　　

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