摘要：综述了AFLP分子标记技术的基本原理、方法及其在植物和病原真菌研究中的应用现状，并探讨了其中存在的一些问题。
　　关键词：AFLP；cDNA-AFLP；植物；病原真菌
　　中图分类号：Q93，Q94，Q7
　　文献标识码：A
　　文章编号：1673-0925(2008)01-0067-06
　　
　　自从1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构以来，核酸分子生物学技术发展迅速，并且得到了广泛应用。随之，DNA分子标记技术产生并得到迅猛发展，应用于各个研究领域。首先出现了以分子杂交为基础的DNA分子标记，即限制性片段长度多态性(restriction fragment polymorphism，RFLP)。它是通过Sounthern杂交技术检测基因组总DNA多态性的共显性分子标记，其结果稳定、可靠，但操作繁琐，灵敏度不高。自从1985年美国科学家Mullis发明了PCR技术以来，以PCR为基础的DNA分子标记相继出现，如RAPD、SSR、AFLP、SRAP、TRAP等。RAPD(random amplified polymorphism DNA)是利用10bp左右的随机引物，在不需要预知基因组DNA序列的情况下，对整个基因组DNA进行多态性扩增。但该技术对实验要求较高，结果不稳定，重复性差。之后综合RFLP和RAPD 2种分子标记技术又发展了一种新的技术——AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术，它克服了RFLP的操作繁琐、灵敏度不高和RAPD的稳定性差、重复性不好的缺点，同时又兼具这两者的优点，是一种高效的分子标记技术，而且AFLP标记可以转成特异性SCAR标记。目前该技术已经在遗传图谱构建、基因定位、种质资源鉴定、遗传多样性研究、分子标记辅助育种、病原诊断以及流行病学等各个领域得到广泛应用。另外，在AFLP技术的基础上发展起来的cDNA-AFLP技术具有假阳性率低、操作方便等优点，适合于mRNA差异表达的研究。
　　
　　1　AFLP分子标记技术的原理和方法
　　
　　AFLP分子标记技术是由荷兰科学家Zabeau和Vos于1992年发明的，并获得欧洲专利。它是将RFLP和RAPD技术相结合而发展起来的第3代分子标记技术，可靠性和灵敏度高，多态性丰富，结果稳定可靠。在不必预知基因组DNA序列的情况下，利用2种限制性内切酶(通常采用Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切)对基因组总DNA进行双酶切，产生了具有不同粘性末端的大小不同的酶切片段；加上特定的双链人工接头(以接头序列和邻近的限制性酶切位点序列作为引物结合位点)，利用特定的引物(AFLP的引物序列包括与接头序列相对应的核心序列、酶切位点识别序列和选择性碱基)进行预扩增和选择性扩增；最后通过5％或6％(质量分数)的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经银染、荧光标记或同位素标记等技术检测扩增条带多态性。如果基因组DNA序列内出现碱基插入、缺失、重复以及在限制性内切酶识别位点上出现碱基突变等，酶切片段的数量和长度都将发生改变；再通过PCR反应进行预扩增和选择性扩增，经电泳和条带检测后，这些变化将充分呈现在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶上。整个操作流程如图1所示。
　　
　　
　　2　AFLP技术操作要点
　　
　　首先，AFLP技术对模板DNA质量的要求很高，模板DNA的完整性和纯度是影响PCR扩增多态性结果的一个关键因素；其次，基因组总DNA是否充分酶切是影响AFLP分析的另一个关键因素。因为EcoR Ⅰ是多酶切位点酶，而Mse Ⅰ是酶切位点较少的酶，所以通常采用Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的方法。采用这种方法产生的酶切片段，不仅可以减少选择性扩增时所需要的选择性碱基数目，还能调节扩增谱带的数目。在不清楚DNA序列的情况下，利用该引物对进行PCR扩增，可产生大量长度不同的DNA序列片段。其扩增产物在尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，丙烯酰胺和尿素的质量会影响AFLP扩增片段的分辨率。制备凝胶和电泳过程中的操作也会对检测结果产生一定的影响，因此玻璃板要清洗干净；灌胶时胶液要平齐前进而且不能有气泡出现；点样之前要多次冲洗点样孔，防止点样时胶孔里存有杂质而使样品点不进去或漂出胶孔，造成条带弯曲变形；胶面温度不能过高，否则会导致玻璃板破裂；电泳电压过高，条带会显得坚锐而不扩散；电泳缓冲液的浓度过低，会使电压攀升太快；点样时间不宜过长，否则样品会发生渗透、串样，而使条带很难分辨。PCR扩增产物的多态性检测技术是由同位素标记、生物素标记技术及银染技术向荧光标记技术的转化。其中银染技术相对来说比较常用，它克服了同位素标记检测方法的消耗时间长、不安全性和成本高等缺点，使得整个试验过程周期短且安全；但是其整个流程长，步骤繁琐，对操作人员的技术要求高；而且影响银染检测的因素也很多，如银染过程所需的各种药品、温度、漂洗和显影等。越来越多的新银染技术正被建立和应用，各种影响因素也将被不断地克服。
　　
　　3　AFLP技术的应用
　　
　　3.1　遗传图谱构建与基因定位
　　相对于RFLP和RAPD，AFLP具有重复性好和灵敏度高的特点，被认为是目前构建遗传图谱最为有效的分子标记技术。YU et al利用AFLP和RAPD技术分析了2种中国大白菜177和276号的102个重组群体，共获得265个AFLP标记和87个RAPD标记，聚成17个连锁群，获得了总图距为2665.7cM、标记间平均距离为7.6cM的遗传连锁图谱。郝转芳等利用1个F：作图群体(X178×B73)，首先构建了一个含有130个SSRs的玉米连锁框架图，然后用117个AFLPs位点增加图谱密度，得到一个全长1659.3cM、标记间平均间距6.66cM的玉米相对饱和连锁图。王晓武等利用青花菜(Brassica oleracea var.italica)与芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra)杂交后代双单倍体(DH)群体为材料，通过AFLP技术构建了一个甘蓝类作物较高密度的遗传连锁图谱。该图谱包括9个主要连锁群及2个小连锁群，含337个AFLP标记，总图距801.5cM，标记间平均距离3.6cM，为甘蓝类作物基因定位、比较基因组学及重要经济性状QTL分析提供了一个框架图谱。
　　将AFLP技术与BSA(bulk segregate analysis)相结合，可以对基因进行快速准确的定位。郭军等以具有和不具有无毒基因Avr1表现型的马铃薯晚疫病菌株80029(AVR1)和88133(avr1)及其杂交F₁代50个菌株群体为供试材料，以限制性内切酶Pst Ⅰ和Hha Ⅰ为酶切组合，采用荧光AFLP技术和混合分组分析法(BSA)，通过256对引物筛选得到了5个与Avr1连锁的候选AFLP标记，并进行菌株个体验证，遗传分析结果表明5个标记中有2个标记与Avr1连锁。邵映田等以抗条锈病基因Yr10的供体亲本Moro

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