摘要：植物抗病基因在植物抗病过程中起重要作用。综述了植物抗病基因的克隆方法，结构特点，作用机制以及未来的发展前景。
　　关键词：R-基因；克隆方法；结构特点；作用机制
　　中图分类号：S432.²⁺3；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2008)05-0598-03
　　
　　Advance on Plant Resistance Gene Research
　　SUN Wen-li1，2，3，LIU Yu-hui2，3，WU Yuan-hua1，FU Jun-fan1
　　(1. Plant Pathology Department，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China；
　　2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；
　　3. Important Scientific Engineerings of Gene Resources and Gene Improvement of China＇s Crops，Beijing 100081，China)
　　Abstract：R gene played an important role in defending the disease. This paper reviewed the gene cloning，structure characteristic，function mechanism and the foreground of R gene.
　　Key words：R gene，gene cloning，structure characteristic，function mechanism
　　
　　R基因在植物的病害防御过程中起着非常重要的作用。植物时刻受到周围各种潜在病原菌的侵染。一旦病原菌侵入植物表皮，将遇到R基因和avr基因的互作，即植物的非寄主抗病性[1]。随之所产生的现象包括局部细胞坏死(过敏性细胞死亡)，木质素和胼胝质形成，以及所有与抑制病原菌生长和病害发生相关的抗菌物质产生。病原菌还有可能通过不同的途径赋予植物长期的系统抗性诱导系统免疫，使植物能抵抗其他相似病原菌的侵染[2]。随着分子生物学的发展，更多的植物抗病基因克隆方法及作用机制逐渐为人们所发现，也有更多的植物抗病基因的功能得到了证实。
　　
　　1 R基因的克隆方法
　　
　　1) 表型基因克隆法：利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型基因与结构基因表达的特征联系起来，从而分离特定的与表型相关的基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就能直接分离该基因。
　　2) 转座子标签技术：转座子标签技术是比较经典的方法，是将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部，基因发生突变而被标识，然后利用插入<=6片段做探针克隆到抗病基因。
　　3) mRNA差异显示法：是由Peng Liang等人在1992年建立的筛选基因差异表达的有效方法。它是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。具体操作流程如下：组织样品总RNA的提取→去除RNA样品中的微量DNA→设计引物序列→逆转录归类反应体系的建立→PCR选择性扩增→mRNA DD-PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳→差异表达条带的回收→回收条带的再次扩增→二次扩增产物的克隆、测序和GenBank查询→Northern Blot和Dot Blot杂交。
　　4) 功能克隆：即利用病害已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋白质氨基酸缺陷的信息进行基因定位，进而克隆该致病基因。
　　5) 同源序列克隆基因：根据已知的抗病基因设计引物，从相近物种中克隆其同源基因。
　　6) DNA芯片技术：一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。
　　7) 图位克隆法：针对寄主植物与病原菌互作的遗传模式(即与亲和性因子相关的互作模式或与非亲和因子相关的互作模式)创造R基因近等基因系(near isogenic line，NIL)及作图群体材料。由于常用的F2代作图群体不很稳定，目前发展了以双二倍群体DHL(double haploid population)、重组自交系RIL(recombinant inbred line)以及回交世代为材料。之后用RAPD和RFLP等方法对R基因进行定位，找到与R基因紧密连锁的分子标记，并以此作为起始探针，借助“染色体步行(chromosome walking)”或“染色体登陆(chromosome landing)”，在含目的R基因的植物基因组YAC或BAC文库中筛选分离出目的基因，并通过转化互补试验进行验证。
　　8)生物信息学的方法用于新基因的发现和鉴定。表达序列标签EST(expressed sequence tags)是基因表达的短cDNA序列，它们携带完整基因某些片段的信息。大多数情况下，EST克隆并不跨越基因的全长区，但有许多生物信息学工具可以帮助获取某一基因的全长转录体信息及其在染色体作图中的精确定位。近几年EST数据库的快速增长，增加了从EST出发寻找新基因的可能，特别是从试验测得的与功能联系的新EST发现新基因的可能性更大，通过对已知功能的抗性基因EST序列片段的拼接，以及EST序列和基因组序列的比对，可以寻找新的全长抗性基因[3]。
　　
　　2 已经克隆得到的R基因及分类
　　
　　第1个植物抗病基因Hm1是从玉米中分离得到的。Johal和Briggs利用转座子标签法首次从玉米中克隆到抗圆斑病基因Hm1。该基因编码依赖于NADPH的HC毒素还原酶，该酶能降解玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)生理小种1所产生的毒素，从而使玉米获得抗性[4]。据不完全统计，到2006年已克隆的植物抗病基因有51个，其中大部分基因从双子叶模式植物番茄(Lycopersicum esculent um)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中获得。在粮食作物中，人们已克隆到15个抗病基因，其中水稻(Oryza sativa)5个、马铃薯(Solanumt uberosum)4个、大麦(Hordeum vulgare)3 个、玉米(Zea mays)₂个和小麦(Triticum aestivum)1 个(表1)[5]。
　　尽管R基因之间的序列同源性很低，但是这些R基因编码的蛋白也具有一些相似的结构特征，根据这些结构特征，已经克隆的R基因可以分为5个大类：STK，LRR-TM，NBS-LRR，LRR-TM-STK和Hm1。
　　1) STK类R基因如番茄Pto基因，其产物是一个没有LRR结构域，位于细胞质内的典型的丝氨酸-苏氨酸激酶(Ser-Thrkinase)，通过丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化来传递信号[6]。目前已经有证据表明Pto蛋白能与相应无毒基因avrPto的产物相互作用。
　　

1 [2] [3]