全基因组基因表达分析技术及其在果树上的应用
2008/3/1 来源:果树学报 作者:张志宏 赵进春 代红艳


  摘要:基因表达分析对于揭示基因功能、了解基因间相互关系、阐明植物生长发育过程中的生理生化调控机制起着至关重要的作用。综述了mRNA差异显示、cDNA—AFLP、基因芯片、EST数据分析、基因表达系列分析(SAGE)等全基因组基因表达分析技术的原理特点及在果树上的应用情况,并介绍了利用全基因组基因表达分析技术开展果树研究的思路。
  关键词:果树;基因表达;基因芯片;表达序列标签;基因表达系列分析
  中图分类号:S66 文献标识码:A
  文章编号:1009-9980(2008)03-382-07
  
  高等生物基因组中多数基因在表达上具有时空特异性。基因表达分析对于揭示基因功能、了解基因间相互关系、阐明植物生长发育过程中的生理生化调控机制起着至关重要的作用。传统的基因表达分析技术是Northera印迹杂交,通过杂交信号的强弱直接反映出基因表达的强度。结果直观且非常可靠,但是一次杂交实验只能鉴定一个基因的表达情况,且灵敏度也不是非常高。随着聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术的普及,反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerasechain reaction.RT-PCR)技术成为单个基因表达分析的首选方法。与Northern印迹杂交相比,RT-PCR具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、成本低等优点,而且采用多重RT-PCR技术还可以同时分析几个基因的表达情况,此外,采用实时定量RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)还可以估算出基因的转录本数目,能够对基因的表达进行精确的定量分析,所以,实时定量RT-PCR已成为单个基因表达分析的主要方法。
  生物体内的反应呈网络状,随着基因芯片(genechip)、基因表达系列分析(serial analysis of gene ex-pression,SAGE)、大规模平行信号测序(massively par-allel signature sequencing,MPSS)等技术的出现及GenBank中表达序列标签(expressed sequence tag,EST)数据量飞速增长,人们能够同时监测全基因组的基因表达信息。目前,拟南芥的基因表达分析研究已经非常系统和深入。这为非模式植物的基因表达分析提供了良好的借鉴。作者简单介绍mRNA差异显示、cDNA-AFLP、基因芯片、EST数据分析、SAGE等全基因组基因表达分析技术的原理特点及在果树上应用情况,为科研人员开展果树基因表达研究提供借鉴。
  
  1 mRNA差异显示的原理及其在果树上的应用
  
  1992年,Liang等在RAPD-PCR和RT-PCR技术基础上建立了mRNA差异显示(mRNA differ-ential display)技术,也称作差异显示RT-PCR(Dif-ferential display RT-PCR,DDRT-PCR)技术。该技术是根据绝大多数真核生物mRNA具有多聚腺苷酸(polyA)尾结构的特点,利用含oligo(dT)的3’一锚定引物(TuMNM为A、C或G,N为A、C、G或T)和5’端的随机引物(长度10 nt)对mRNA进行选择性扩增。12个3’端锚定引物与20个5’端随机引物组合形成的240对引物大约能扩增产生2万条DNA谱带,其中每一条谱带都代表一种特定的mRNA,大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收和鉴定,可以获得差异表达基因的片段。
  与差别杂交(differential hybridization)和差减杂交(subtractive hybridization)等技术相比,mRNA差异技术显示具有简便、灵敏、可重复性好等优点,因此该技术发明后很快得到广泛应用,成为真核生物基因表达分析一种重要的技术手段。但是mRNA差异显示技术也存在一些不足,主要是由于PCR反应条件不够严谨导致假阳性率高,且有时扩增谱带的强度与基因的表达水平并不相关,再有,mRNA差异显示主要展示的是基因表达模式,不能提供全面的表达分布图。
  mRNA差异显示技术已被应用到多种果树的基因表达研究中,如Lang等利用mRNA差异显示技术从柑橘中鉴定出8个在叶片中表达的冷适应基因;Thomas等利用该技术研究葡萄试管苗瓶内生根与瓶外生根在基因表达上的差异,结果表明2种环境条件下葡萄苗的基因表达模式是一致的。
  
  2 cDNA—AFLP的原理及其在果树上的应用
  
  2.1 cDNA-AFLP的技术原理和特点
  扩增片段长度多态性(Amplified fragment lengthpolymorphism,AFLP)是20世纪90年代初创立的分子标记技术,是RFLP与RAPD相结合的产物,以扩增片段的长度来展示限制性内切酶酶切片段的长度多态性。AFLP是以基因组DNA为研究对象的,1996年Bachem等将反转录和AFLP结合在一起,创立了以mRNA反转录成的互补DNA(complemen,tary DNA,eDNA)为研究对象的AFLP分析技术——cDNA-AFLP。与mRNA差异显示技术相比,cDNA-AFLP在基因表达分析上具有重复性好、假阳性率低、可检测低丰度表达的基因、准确反映基因间表达量的差别等优点,与基因芯片技术相比,cDNA-AFLP具有无需预先知道基因序列信息的优点,因此cDNA-AFLP技术是基因表达研究的有效工具。
  
  2.2 cDNA-AFLP技术在果树上的应用
  cDNA-AFLP技术已在诸多生物上得到广泛应用,近几年来,已有一些利用cDNA-AFLP技术进行果树全基因组基因表达分析和基因克隆的报道。Geuna等利用cDNA-AFLP技术分析杏(Prunus ar-meniaca L.)果实发育及成熟过程中基因表达的差异,利用34个不同的引物组合在6个发育阶段中共筛选出265个不同的cDNA-AFLP谱带,对其中125个谱带进行克隆、测序分析,发现这些差异表达的基因与细胞壁、糖、脂类物质、有机酸、蛋白质代谢及激素信号转导有关,其中41%的差异表达基因与激素信号及信号转导有关。Jensen等以苹果砧木M.7 EMLA(半矮化砧木、可减少接穗品种对火疫病的敏感性)和M.9 T337(矮化砧木,不改变接穗品种对火疫病的敏感性)为试材,利用cDNA-AFLP技术研究砧木对接穗基因表达的影响,表明嫁接在M.9T337上的嘎拉苹果的茎尖组织中光合作用相关基因、转录/翻译相关基因、细胞分裂相关基因高度表达,与其相反,嫁接在M.7 EMLA上的嘎拉苹果高

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