植物基因组DNA提取
2008/2/1 来源:中国教育技术装备 作者:敬国兴 赖小玲 李伏钦 曾富华


  摘要 介绍在教学实验中分别采用SDS法和CTAB法对辣椒基因DNA进行提取的过程,结果表明,改进的CTAB法提取的DNA含量较高且纯度较好;同时发现在电泳检测过程中,恒定电流检测图像结果中呈现的基因组DNA条带要比恒定电压检测结果平整。
  关键词 辣椒;DNA;电泳
  中图分类号:G642.423 文献标识码:A 文章编号:1671-489X(2008)20-0127-02
  
  DNA提取是进行分子生物学研究的第一步,也是大学生必须掌握的专业实验技能。现有的植物DNA提取方法很多,在教学过程中可根据材料本身特点的不同而选择不同的方法。目前使用较多的是SDS(十二烷基硫酸钠)法、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)法[1],主要用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物DNA提取。在辣椒基因组DNA提取过程中,由于叶片中富含的酚类物质可使DNA降解,也可与DNA结合形成沉淀物,严重影响DNA的提取效果[2-3]。本文以教学实验植物基因组DNA提取中SDS方法[4]为基础,然后利用改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)法提取辣椒基因组DNA与之进行比较,摸索适合辣椒基因组DNA提取的方法,以便更好地服务于实验教学。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 实验材料以常规辣椒品种保加利亚尖椒幼嫩叶片为实验材料,采集新鲜叶片数片洗净后再用去离子水清洗2次,晾干,置于4 ℃冰箱冷藏室内备用。
  1.2 方法
  1.2.1 DNA提取
  1)SDS(十二烷基硫酸钠)法见参考文献[4]。
  2)CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)法[5]。
  ①称取干燥新鲜叶片约0.4 g置于干净的研钵中,剪成小片,加液氮充分研磨约8 min,至粉末呈浅灰绿色即可。
  ②将磨碎的粉末等量分装于4个1.5 mL的微量离心管中,各加1 mL预热(约50 ℃)的2×CTAB缓冲液[含2% CTAB(Cetyltrimethy Ammonium Bromide,Sigma),1.4 mol/L NaCl,25 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris-Cl,pH8.0,0.2%β-巯基乙醇(V/M)],充分摇匀。
  ③60 ℃保温1.5 h,每隔15 min~20 min摇匀一次。然后室温放置30 min,其间摇动1~2次。
  ④10 000 r/min离心5 min,弃沉淀,取上清液移至新管,加氯仿-异戊醇至满管,并用力摇匀。
  ⑤10 000 r/min离心10 min,弃沉淀,取上清液移至新管,加氯仿-异戊醇至满管,并用力摇匀。
  ⑥10 000 r/min离心10 min,弃沉淀,取上清液。先加1/10体积预冷(4 ℃)的3 mol/L NaAc,再加预冷(4 ℃)的异丙醇至新管,将离心管轻轻翻转几次(约5 s),-20 ℃放置2 h以上或过夜。
  ⑦10 000 r/min离心10 min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗脱2次,再用无水乙醇洗脱一次。晾干(或用灭菌过的滤纸吸干)后,加50 μL 1×TE溶液溶解。
  ⑧加入1 μL 10 mg/mL的RNase溶解DNA,30 ℃水浴或室温1 h去除RNA,置-20 ℃保存备用。
  1.2.2 电泳检测在恒定电压(80 V)或恒定电流(80 mA)的条件下,取5 μL DNA加2 μL上样缓冲液,于1%的琼脂糖凝胶(含0.5 μg/μL EB)中电泳检测,用凝胶成像系统保存图像,通过带形分析来比较DNA的完整性等质量特点。
  
  2 结果分析
  
  如图所示,经SDS法、CTAB法提取辣椒基因组DNA均获得成功(图1、图2),但通过带形分析,等量DNA经电泳检测后亮度呈现不同,表明这两种方法提取的DNA总量有较大差别。由图2可知,CTAB法提取的DNA含量较高且纯度较好,能直接用于PCR、RAPD和RFLP等分子实验。
  
  此外,在实验中还发现,恒定电流条件下DNA条带比恒定电压电泳结果平整,表明在此实验中恒定电流更适合于电泳检测。
  
  3 讨论
  
  DNA提取方法主要是采用破壁和破膜的方法,SDS、CTAB等去污剂均能够破坏细胞膜使蛋白质沉淀下来,从而释放DNA;同时在一定的盐浓度下,它们也可以沉淀色素和多糖。本研究表明,在富含酚类物质的辣椒叶片DNA提取过程中,改进的CTAB法提取的DNA含量较高且纯度较好,比SDS法好。所以在以后的实验教学过程中,一般应采用CTAB法,因为CTAB法不仅简便、快速,而且DNA产量高,适用于一般分子生物学操作。
  在电泳过程中,将电泳仪调至水平,然后在恒定电压条件下进行电泳检测,多次DNA条带电泳结果均呈现一定程度的不平整现象。在采用CTAB法提取DNA后,采用恒定电流的条件进行电泳检测,结果大有改观。出现此现象的原因可能是在电泳过程中电泳液和凝胶温度不断升高,导致电阻变化,从而引起电流不稳定造成的。
  通过研究表明,用改进的CTAB法提取植物基因组DNA,在恒流电泳的条件下DNA电泳检测更有利于植物基因组DNA提取的实验教学,可以进一步在实验中推广使用。
  
  参考文献
  [1]王关林,等.植物基因工程原理与技术[M].第二版.北京:科学出版社,2002,742-749
  [2]Proberki S L, Bailey G, Baum R B. Modification of a CTAB extraction protocol for plant containinghigh polysaccharide and polyphenol components[J].Plant Mol Rep,1997(12):8-15
  [3]王岩,等.辣椒叶片DNA提取方法的优化[J].长江蔬菜,2006,8:59-61
  [4]魏群,等.分子生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1999,69-70
  [5]李建武,等.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社,2001,264-265