植物抗寒基因工程研究进展
2007/2/1 来源:现代农业科技 作者:王 华 杨建峰


  摘要 低温是影响植物生长发育及分布的一个很重要的环境因子。从导入抗寒功能基因和抗寒调控基因两个方面对当前植物抗寒基因工程的研究进展及研究方向作了系统的阐述。
  关键词 植物;抗寒基因;转基因植物;研究进展;展望
  
  低温是影响植物生长、发展、生存及分布的一个很重要的环境因子。全球每年因低温寒害造成的农作物损失高达数千亿美元[1]。植物抗寒一直以来都是国内外研究的重点。随着植物生理学、形态学、遗传育种学、细胞学和分子生物学等理论和方法的日益完善,植物冷驯化和抗寒分子机理的研究取得了显著进展,植物抗寒基因工程也随之得以广泛开展,目前已经发展了100余种转基因抗寒植物,涉及50多个物种[2]。用基因工程的方法培育抗寒植物正以其周期短、见效快的优点而逐渐在植物遗传育种中占有重要地位。
  目前,国内外植物抗寒基因工程主要针对抗寒功能基因和抗寒调控基因展开。导入抗寒功能基因研究策略,一方面是从植物或植物以外更广泛的物种范围获取“抗寒”基因转入植物来打破植物遗传群体中抗寒冻种质资源缺乏的限制;另一方面是利用植物自身的生理代谢保护机制制定相应的遗传策略,如提高植物体内不饱和脂肪酸的含量、加强膜脂过氧化防御系统中酶的活性等。导入抗寒调控基因主要是围绕一种与抵抗寒冷所导致的渗透胁迫相关的冷诱导基因转录因子CBF(DREB)展开。
  
  1导入抗寒功能基因的研究
  
  1.1抗冻蛋白基因及其转基因植物
  抗冻蛋白(antif reeze proteins,AFPs)是20世纪60年代从极区海鱼的血清中发现的一种具有阻止体液内冰核的形成与生长、维持体液的非冰冻状态的高效抗冻活性物质。之后,研究对象从极区鱼扩展到昆虫。植物AFP的研究较晚,直到1992年加拿大Griffith等[3]才第一次提出从植物中获得内生AFPs。之后,美国圣母大学的Duman实验室在多种植物中发现了有热滞效应的蛋白质[4],1994年,费云标等从常绿抗冻植物沙冬青(Ammopiptanthus monglicus)叶片分离到了抗冻蛋白[5],1996年,卢存福等在高山植物唐古特红景天叶片及悬浮培养细胞中获得具有抗冻活性的蛋白质(AFPs)[6]。
  综合目前的文献资料,AFPs具有三大特性:①热滞效应,即AFPs能非依赖性降低溶液冰点;②冰晶形态效应,即AFP能抑制冰晶生长,引起冰晶形态的改变;③重结晶抑制效应,即AFPs具有抑制重结晶发生的作用,所形成的晶粒体积小且均匀[6-8]。AFPs 基因工程的目的基因多来源于鱼类。Davies等[9]将美洲拟鲽抗冻基因(afp)整合在Ti质粒上,用叶圆片法转化郁金香、烟草和油菜等获得一定的抗冻力。Georges等[10]将人工合成的鲟鱼afp基因导入玉米原生质体中获得表达,改良了植物的抗寒性。Hightower等[11]将极区鱼AFPs蛋白的afa3、afa5和Spa-afa5(葡萄糖球菌A蛋白基因和afa5基因相连接的嵌合基因)基因由农杆菌介导对烟草和番茄实施遗传转化,最终得到afa3基因转化的烟草和番茄,Spa-afa5基因只得到番茄转化植株。转基因植株的进一步检测发现,afa3基因能够表达出高稳定态的mRNA,但未检测到AFP对组织提取物中冰重晶化的抑制作用,只有携带Spa-afa5基因的转基因番茄果实中冰晶较未转移植株明显减少,具有很强的冷冻耐受性。Kimberly等[12]将AFPⅠ型鱼类抗冻蛋白导入烟草中,在低温下亦检测到了抗冻蛋白的活性。黄永芬等[13]用花粉管通道和子房注射法将整合在 Ti 质粒上的美洲拟鲽afp基因导入番茄中,田间抗寒性表明,转基因植株在低温下的生长势优于对照,致死温度也比对照降低 2℃。
  近年来,通过鱼类AFP基因的导入来提高作物的抗寒冻性研究方面取得了一些有益的进展,但多数情况下并不理想。毕竟鱼类和植物在分类学上的关系太远,基因结构差异太大,因此我们寄希望于植物AFPs基因的深入研究和利用。
  Worrall等[8]在应用植物AFPs基因方面作了有益的尝试,他们将胡萝卜afp的cDNA连接在双CaMV 35S 启动子之下,导入烟草,让其组成型表达。结果表明,含有胡萝卜AFP的烟草提取物可以抑制烟草细胞冰晶的生长。尹明安等[14]也克隆了胡萝卜的AFP基因,构建了植物表达载体并转化番茄,还未见结果报道。
  1.2抗渗透胁迫相关基因及其转基因植物
  1.2.1COR基因。低温诱导蛋白是植物在低温作用下,由于基因表达的改变而诱发合成的蛋白质。一些转基因研究证明,导入冷诱导基因确实具有提高植物抗寒性的功能。目前,这一方面研究较深的是COR(Cold-regulated)家族蛋白基因。拟南芥菜COR基因有4个基因家族COR6.6、COR15a、 COR78和LEA(late-embryogenesis abundant)蛋白同源的COR47,且每个家族由2个串联连锁的基因组成。在对拟南芥COR15a[15]、苜蓿CAS15[16]、小麦WCS120[17]和大麦HVAI [18]等冷诱导蛋白结构分析时发现它们具有共同特征:亲水氨基酸丰富,含简单的氨基酸组成和重复的氨基酸序列;功能上,亲水氨基酸残基排列在一侧,以氢键与冰结合,来降低体液的结冰温度,疏水氨基酸残基排列在另一侧,与膜结合而保护细胞膜免受寒害的作用。Thomashow M.研究发现,拟南芥受低温、干旱或ABA 处理时能诱导COR15a 蛋白基因表达产生15kD 的多肽,此多肽与叶绿体结合后转变为94kD 的多肽COR15am[19]。Artus N.N.等使COR15am多肽在转基因拟南芥中大量表达后,与野生型相比,转基因植物分别提高叶绿体和原生质体的耐寒冷性,并增强原生质膜稳定性,减轻寒冻损害[20]。
  1.2.2渗透调节相关酶基因。低分子量的渗透调节物质(糖醇、特殊氨基酸、甘氨酸甜菜碱及脯氨酸等)的积累,被认为是增强植物对渗透胁迫适应和耐受的主要机制[21,22]。前人的研究表明,在植物中导入糖代谢或脯氨酸代谢相关酶基因,转基因植株中糖分和脯氨酸的含量增加,增强了转基因植株对水分和盐胁迫的耐受性[23,24]。寒冷胁迫和渗透胁迫之间有着密切的关系,植物在抵抗寒冻所导致的渗透胁迫过程中,体内也积累大量的糖类和脯氨酸等渗透调节物质,并伴随有多种冷诱导蛋白的表达。因此,此类基因可作为抗寒候选基因加以应用。肌醇半乳糖苷酶基因(GolS)即属于这一类。它催化从 UDP-半乳糖生化合成可溶性棉子糖家族(RFO)反应的第一步[25],并且在蔗糖和 RFO 的碳元素分配上起着重要的调节作用[26]。RFO(如肌醇半乳糖、棉子糖等)作为一种渗透保护剂在植物的抗寒及抗旱中起了很大的作用[27]。研究发现,在耐霜冻植物夏枯草(Ajuga reptans)[28]和松针(Pine needles)[29]中发现有大量 RFO 积累。Brenac等[30]在对玉米种子的研究中发现,蔗糖含量的积累与抗寒和抗旱无关,而 RFO 的积累与此有关。这就说明了在抗寒与抗旱中真正起作用的是 RFO 的比例而不是总糖的含量。
  肌醇半乳糖苷酶是一种重要的代谢调控点,它的基因为研究RFO在种子及其他组织中起渗透保护剂提供了入手点。Taji等[27]研究发现,拟南芥肌醇半乳糖苷酶基因(AtGolS3)其启动子中含有2个CRT/DRE中心基序及2个类似CRT/DRE基序,CBF3能够结合到这些基序上,从而诱导AtGolS3表达,增加植物的抗寒性。
  

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