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蕙兰的无菌播种及根状茎培养技术研究


  [摘要]蕙兰是一种具有很高商业价值的兰科植物,传统上采用分株繁殖。研究其果实的发育时间和预处理方式对种子无菌萌发的影响,发现授粉后120d,种子的萌发率最高(为2.7%),而0.1mol·L-1NaOH溶液对提高种子的萌发率没有明显作用。进而讨论了不同因素对蕙兰根状茎增殖的影响,结果表明:MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L或B5+NAA0.5mg/L+BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的培养基最适于根状茎的增殖。
  [关键词]蕙兰 无菌播种 根状茎 组织培养
  中图分类号:S6 文献标识码:A 文章编号:1002-6908(2007)1120045-01
  
  一、前言
  近年来,墨兰、建兰的组织培养报道渐多,而关于蕙兰的报道则少见。本文探讨了其果实成熟度和NaOH溶液预处理方式对蕙兰种子萌发的影响,并由种子诱导出了发育良好的根状茎。进而研究了不同的培养基类型和NAA与BA的浓度配比对根状茎增殖的影响,提出了适合根状茎增殖的培养基配方,还繁殖出少量完整植株,为实现中国兰的大规模工厂化育苗提供科学依据和技术支持。
  
  二、实验材料和方法
  (一)实验材料
  供试材料为经人工授粉后采收的盆栽蕙兰的蒴果。
  (二)实验方法
  1.人工授粉和蒴果采收。选取生长健壮、无病虫害的蕙兰植株作为母本。要求苗数在10苗左右,花葶3枚以上。按照程式君(1984)的方法,在母株开花之前事先收集另一蕙兰植株的花粉块放在滤纸上,卷成筒状,放在小瓶中,塞紧,置于干燥器内,放在4℃冰箱中保存。在母本花葶上每朵小花开放的第二天,除去其自身的花粉块,授以预先收集的花粉,每一花葶上保留2~3个发育良好的蒴果。将蒴果分为四组,分别于授粉后的第60、120、180、240d采收,供后续实验之需。
  2.种子的无菌播种和原球茎的诱导。将采收的未开裂蒴果置于流水下冲洗干净,在超净工作台上先用70%的酒精浸泡1min,再用0.1%升汞溶液浸泡15min,无菌水冲洗5次。然后将消毒后的蒴果纵切为二,用镊子夹取着生于侧膜胎座上的种子,置于盛有无菌水的小烧杯中,使种子悬浮于无菌水上部,再用滴管将其移入培养基中,轻摇培养瓶,使种子均匀分布在培养基上。此外,另取一组种子,用0.1mol·L-1的NaOH溶液进行10、20、30min的浸泡预处理,消毒后接种于相同培养基上,比较其与未经过处理的种子在萌发率上是否存在差异,重复三次。在培养室中培养90d后统计萌发率。
  无菌播种的培养基成分为1/2MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+
  琼脂6g/L+0.2%AC,调节PH值至5.0~5.4。
  3.根状茎的培养。播种60~80d后,种子陆续萌发,形成原球茎,30~40d后即发育成根状茎。将发育良好的根状茎转入不添加任何植物生长调节剂的MS+蔗糖6g/L+0.2%AC的培养基中,继代4次后,再将其转入以下9组培养基中:
  (1)MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L
  (2)MS+NAA0.5mg/L+BA1.0mg/L
  (3)MS+NAA0.5mg/L+BA2.0mg/L
  (4)W+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L
  (5)W+NAA0.5mg/L+BA1.0mg/L
  (6)W+NAA0.5mg/L+BA2.0mg/L
  (7)B5+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L
  (8)B5+NAA0.5mg/L+BA1.0mg/L
  (9)B5+NAA0.5mg/L+BA2.0mg/L
  上述各组培养基均添加3%的蔗糖和0.6%的琼脂,调节PH至5.0~5.4。每个培养瓶接种三条根状茎,重复三次。培养60d后统计根状茎增殖的倍数。
  以上各试验的培养条件均为:温度25±2℃,光照强度2000lx,光照时间16h/d。
  三、结果与分析
  (一)果实发育时间与种子萌发率的关系
  分别采收授粉后第60、120、180和240d的未开裂蒴果,经表面消毒后,在无菌条件下,取出种子,均匀地播于前述的培养基上。90d后统计萌发率,其结果见表1。
  表3-1 果实发育时间与种子萌发率统计表
  试验结果表明,授粉后种子能否萌发与果实成熟度密切相关。授粉后60d的果实,种子的胚发育不成熟,萌发率低;授粉后240d的果实,可能积累了过多的生长抑制物,萌发率也有所降低。以采收授粉后120d的蒴果,进行无菌播种,种子的萌发率最高。
  (二)NaOH溶液预处理对种子萌发的影响
  取一枚发育良好的未开裂蒴果,消毒后将其纵切,将种子分为4份,其中一份直接播种于前述培养基中,其余三份分别经0.1mol·L-1NaOH溶液处理10、20、30min后,用无菌水冲洗后再播种于相同培养基中。90d后统计各组的萌发率并重复三次,结果如下表2所示。
  表3-2 NaOH溶液预处理与种子萌发率统计表
  由上表不难看出,0.1mol·L-1NaO
  H溶液浸泡处理对提高蕙兰种子萌发率的作用并不明显。
  (三)培养基类型和植物生长调节剂浓度配比对根状茎增殖的影响
  种子在培养基上吸水膨胀,不久胚细胞开始分裂,种胚增大,60~80d后陆续萌发,形成原球茎。原球茎不久即伸长形成根状茎,根状茎的生长具有极性,以合轴的方式进行分枝,先端可发育成芽。根状茎的表面有许多瘤状突起,表皮细胞伸长形成白色的吸收毛,可能与吸收水分和营养有关。旺盛生长的根状茎呈深绿色。
  为避免其他因素的干扰,试验前先把发育良好的根状茎转入不添加植物生长调节剂的MS培养基中,连续继代培养4次。再将新增殖的根状茎分别转入述的9组培养基中,60d后统计根状茎增殖的倍数,结果见下表3。
   表3-3 根状茎增殖倍数统计表
  以上的结果表明:蕙兰根状茎增殖的最佳培养基的配方为MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+
  琼脂6g/L或B5+NAA0.5
  Mg/L+BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L。
  
  培养60d后,根状茎的增殖倍数分别可达2.56和2.74。
  四、讨论
  (一)种子萌发和预处理
  一般认为,兰属植物八成熟果实的种子的萌发率较高,即蒴果由绿色转变为黄棕色并且尚未开裂的时候,进行无菌播种效果最佳。但具体合适的萌发时期,因种而异。本试验表明,授粉后120d左右的蕙兰种子萌发率最高,可达2.7%。李哖(1992)认为,墨兰应采用授粉后150d的果实,建兰则为190d。
  兰花虽然种子细小,但数目众多。对于种子难以萌发的地生兰属植物而言,通过合适的预处理方式,提高种子的萌发率,是获取充足后续实验材料的有效手段。段金玉(1982)等报道,未经处理的地生兰种子,在播种后6~9个月内,萌发率最大不超过3%,最小的不足1%。本试验结果表明,0.1mol·L-1的NaOH溶液对种子进行浸泡处理的方式,并非适用于所有的兰属地生种,尚需要探索能显著提高蕙兰种子萌发率的合适预处理方式。
  (二)根状茎培养
  与附生类兰花不同,大多数地生兰属植物由种子产生的原球茎并不直接分化成幼苗,而要经历一个根状茎阶段。而根状茎阶的增殖率主要受培养基类型、植物生长调节剂的浓度、组合和比例的影响(Arditti和Ernst,1993)。其中细胞分裂素、如BA、TDZ等被证实对许多兰花的植株再生最为有效(Seeni和Latha,1992;Nayak等,1997),但在本实验中,蕙兰对BA的浓度差异并不敏感,这也许是由于根状茎中内源激素的影响。此外,在培养过程中发现,蕙兰根状茎的发育并不同步,因为继代时需要对根状茎进行切割,从而导致培养体系中始终存在着发育阶段差异悬殊的分生组织、发育程度不同的根状茎和少量不同叶龄数的幼芽。将幼芽切下转入1/2MS+NAA2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+0.5%AC的培养基中,不久幼苗即生根,60d后苗高10厘米,有3~5条根。若不转换培养基,幼苗也可以继续生长,但叶幅狭细且较瘦弱。据Shimasaki和Uemoto(1990)的报道,NAA/BA比值低,导致寒兰的根状茎形成许多原球茎,但原球茎发育成小植株的过程缓慢,NAA/BA比值高,则使根状茎产生异常细长的幼苗。本次对蕙兰根状茎的研究也获得了类似的结果。
  
  注:本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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